Il 16 aprile 1606 la grande e nuova tela della Madonna dei Palafrenieri fu allontanata dopo solo un mese da uno degli altari più importanti di San Pietro per motivi teologici, di decoro e per la difformità nei confronti della tradizione figurativa. Fu quindi esposta nella collezione del cardinale Borghese, nel salone d'onore del Palazzo di Borgo e, in seguito trasferita a Villa Borghese, nel grande Salone d'ingresso.

La novità dell'immagine stava nella drammaticità esistenziale e umana delle tre persone di fronte al pericolo: Sant' Anna, all'antica, contempla distaccata la scena, Maria si attiva, per insegnare al fanciullo Gesù come si schiaccia il serpente, simbolo del peccato e dell'eresia. tenebre avvolgono le figure in un luogo possibile ovunque, ma irrompe con forza propria dall'alto una luce che è più di quella naturale, e che risplende nell'incarnato del bambino.